|
1988～1997年北京地区流感病毒分离浅析
北京市疾病预防控制中心 丁丽新 刘海林
董振英 吴淑敏
摘要：通过对北京地区10年的流感监测，探明了北京地区流感病毒不同毒株的时间分布和变迁规律，确定了组织培养技术对流感病毒的分离效果，进一步证明了流感的发生与年龄密切相关。
关键词：流感病毒 毒株 分离 变迁
流感是一种急性呼吸道传染病，起病急，传播快，主要症状有发热、咽痛、咳嗽、乏力等等。流感大流行时，对社会造成的损失是巨大的，由于它传染性强，不同年龄组的人都有感染的可能，现代交通的发展也加快了流感的传播速度。因此流感监测一直是卫生防疫工作中的重点。
1、 材料与方法
1.1 标本的采集：1988～1997年，选择北京市和平里医院儿科和内科门诊作为监测点，在流行季节（每年10月至次年4月）每周采集10份疑似流感病人发病初期的咽含嗽液标本。非流行性季节（每年5月至9月）每周采集2份标本，置冰壶送检。
1.2 接种鸡胚：在实验室将采集的标本加10%青、链霉素处理2小时备用。选择鸡胚胚胎活动良好、9～11日龄的来享鸡鸡胚，画出胚胎及气室位置，用处理好的标本进行尿囊腔和羊膜腔接种，各0.2ml。每份标本接种4个鸡胚，然后用石蜡封好开口，放于35℃温箱孵育72小时，置4℃冰箱过夜，分别收获尿囊液和羊水，加1%鸡红细胞做血凝试验。阳性标本用血凝抑制试验监定型别。1996年由于流感病毒发生“0”相变异，实验室改用1%豚鼠红细胞代替鸡红细胞进行血凝试验。
1.3 组织培养分离：由于“0”相流感病毒在鸡胚中难以生长，1996年开始使用狗肾细胞（MD-CK细胞）与鸡胚同时分离流感标本。将长成单层、形态良好的MDCK细胞消化，分装试管。待细胞长成单层，倒掉组织培养液，将细胞用Eagle氏液洗两次，每管加入处理好的标本0.5ml，每份标本接种4管，35℃吸附2小时，倒掉标本液，加入含终浓度0.025%胰酶的组织培养维持液，35℃72小时培养，每日观察细胞病变。收获标本后吸取细胞培养液1%豚鼠红细胞做血凝试验判断结果。
2、 结果和分析
2． 1 1988～1997年流感病毒毒株分离情况如表1所示。从表1可以看出：
表1 1988年~1997年不同型别流感病毒月分布
|
年 月
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
合计
|
|
1998
|
|
|
|
|
|
|
|
|
B（1）
|
|
|
A1(1)
A3(1)
|
3
|
|
1989
|
A1(6)
A3(2)
|
A1(4)
A3(2)
B(6)
|
A3(5)
B(6)
|
|
|
|
|
|
B(1)
|
A3(1)
B(1)
|
A3(4)
|
A3(6)
|
54
|
|
1990
|
A3(5)
B(3)
|
B(5)
|
B(3)
|
|
|
|
|
|
|
|
B(1)
|
|
17
|
|
1991
|
A1(5)
B1(1)
|
A1(4)
B(1)
|
A1(2)
B(3)
|
|
|
|
|
A1(1)
|
B(1)
|
|
|
B(2)
|
20
|
|
1992
|
A3(3)
B(8)
|
A3(4)
B(1)
|
A3(2)
B(2)
|
|
|
|
B(1)
|
|
B(1)
|
B(1)
|
A3(1)
|
A3(3)
B(6)
|
33
|
|
1993
|
A3(4)
B(2)
|
B(1)
|
B(2)
|
|
|
|
|
|
|
B(1)
|
B(7)
|
B(15)
|
32
|
|
1994
|
B(14)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
B(1)
|
|
A3(2)
|
17
|
|
1995
|
|
B(2)
|
B(1)
|
|
B(2)
|
|
|
|
|
|
A1(1)
B(1)
|
A1(3)
B(2)
|
12
|
|
1996
|
A1(1)
A3(7)
B(2)
|
A3(1)
B(1)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A3(10)
B(2)
|
21
|
|
1997
|
A1(1)
A3(7)
B(30)
|
|
B(1)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A1(1)
B(1)
|
41
|
|
总计
|
95
|
32
|
27
|
0
|
2
|
0
|
1
|
1
|
4
|
5
|
15
|
68
|
250
|
注：*：（）内为毒株数。
（1）
一般每年9月份即可分离到少量的流感毒株，12月、1月达到高峰，4月骤然下降。
（2）
10年间，虽然全年都进行监测，但我们分离到的国际代表毒株A/Beijing/32/92、B/Beijing/184/93，国内代表毒株A/京防/57/89、A/京防/32/92、B/京防/184/93、A/京防/53/97均在9月至第二年1月期间分离得到的。提示毒株的变异一般发生在流行季节。
2．2
1988～1997年优势毒株的变迁：虽然每一年中，A1、A3、B三型病毒几乎幸均能出现，但A型毒株多见于流行初期和中期，B型毒株则在流行前期和后期多见（见表1）。从10年监测情况看，A1型流感病毒1991年分离率较高，达到分离总数的60.00%，而1992～1994年均未分离到，1995～1997年仅分离到少量A1型病毒；A3型病毒在1989年出现较多，占分离总数遥55.56%；而近几年B型病毒呈明显上升趋势，1993年和1997年分别达到分离毒株总数的88.24%和78.04%；占绝对优势，见图1。
2．3
组织培养技术在流感病毒分离中的作用：
采用组织培养离技术分离流感病毒与采用鸡胚分离流感病毒的效果比较见表2。从表2可以看出：使用MDCK细胞分离流感病毒的效果明显优于使用鸡胚分离的效果。在相同条件下使用MDCK细胞分离到的47株流感病毒中，而使用鸡胚分离技术仅分离到15株。但是在鸡胚分离到的26株中，11株MDCK细胞分离为阳性。因此应采用MDCK细胞和鸡胚并用的方法分离流感病毒。
表2 组织培养（MDCK细胞）分离与鸡胚分离流感病毒比较
|
标本数
|
MDCK细胞
|
鸡胚
|
|
阳性数
|
阳性率%
|
阳性数
|
阳性率%
|
|
190
|
47
|
24.74
|
26
|
13.68
|
2．4
年龄分布：各年龄流感病毒分离情况见表3。对1992～1997年各年龄组流感病毒分离情况进行统计，发现5～14岁年龄组受流感病毒的侵害明显高于其它年龄组（P<0.01）。其原因可能是0～4岁幼儿，虽然免疫功能尚不完善，但与外界接触较少，感染机会相对较少；而5～14岁青少年组的免疫机能比成人差，而且与外界接触又相对较多，故受感染的机会较大。
表3 1992年~1997年各年年龄组流病毒分离情况
|
年龄
年份
|
0～4
阴性数 阳性数
|
5～14
阴性数 阳性数
|
15～24
阴性数 阳性数
|
25～59
阴性数 阳性数
|
≥60
阴性数 阳性数
|
|
1992
|
72
|
8
|
109
|
19
|
38
|
3
|
86
|
4
|
6
|
0
|
|
1993
|
92
|
5
|
83
|
19
|
19
|
0
|
47
|
4
|
7
|
0
|
|
1994
|
69
|
4
|
128
|
13
|
26
|
0
|
39
|
0
|
5
|
1
|
|
1995
|
57
|
0
|
135
|
9
|
17
|
1
|
35
|
1
|
6
|
0
|
|
1996
|
62
|
1
|
141
|
19
|
16
|
1
|
27
|
6
|
4
|
0
|
|
1997
|
42
|
4
|
112
|
33
|
4
|
1
|
13
|
3
|
4
|
0
|
|
合计
|
394
|
22
|
708
|
112
|
120
|
6
|
247
|
12
|
32
|
1
|
|
X2
|
8.61
|
16.47
|
4.76
|
10.17
|
3.97
|
|
P
|
0.1256
|
0.0056
|
0.4454
|
0.0705
|
0.5532
|
3、 讨论
3．1 本研究结果表明：流感病毒的分离阳性数从每年9、10月份开始上升，至次年4月明显下降，提示每年从10月开始应做好流感预防工作，直至第二年3月，要尽可能地对易感人群进行保护，把流感造成的损失降到最低的限度，预防的重点应放在青少年人群上。
3．2 对流感病毒分离仅用鸡胚方法分离是不够的，而应同时采用MDCK细胞培养和鸡胚分离的两种方法。采用好的实验方法，及早地分离有代表性的毒株，不仅在流行病学上有很大的意义，而且对流感的预防、疫苗的生产也具有非常重要的意义。本研究表明：B型流感已成为近几年流行的主要毒株，容易引起流行或大流行的A型流感毒株较少出现，使人群对A型流感的抵抗力普遍下降。鉴于国际代表毒株频繁地在我国被分离出来，上述危险日益临近。因此应在大流行到来之前充分做好流感预防工作。
|
